‘东试早柚’果实无核成因探究_刘承浪
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华 中 农 业 大 学 学 报
Journal of Huazhong Agricultural University
‘东试早柚 ’果实无核成因探究
刘承浪 1，2，黄文铠 1，闫素云2，周先艳2，董美超2， 徐祥增3，高世德3，高俊燕2，柴利军 1，邓秀新 1
1. 果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室/华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070；
2. 云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所，保山 678000；3. 云南省热带作物科学研究所，景洪 666100
摘要 为明确‘东试早柚 ’果实无核成因，以‘东试早柚 ’及其杂交群体为试材，利用醋酸洋红和苯胺蓝染色 法、杂交授粉及分子标记等手段探究‘东试早柚 ’无核原因 。结果显示：‘东试早柚 ’的花结构完整，花粉活力及萌 发率分别为 94 .80 % 和 86 .20 %；‘东试早柚 ’自交表现为不亲和，而与‘沙田柚 ’杂交亲和；利用 S5、S6 基因型分子 标记从‘沙田柚 ’ב东试早柚 ’的 175 株杂交子代中共鉴定出 F1 代杂种 164 株，排除了‘东试早柚 ’雄性不育的可 能；连续 2 a 田间试验观察显示，‘东试早柚 ’刺激性单性结实和天然单性结实的平均座果率分别为 13 .04 % 和 25.56 % 。结果表明，‘东试早柚 ’自交不亲和并具有一定的单性结实能力是导致其无核的主要成因。
关键词 ‘东试早柚’；雄性不育；自交不亲和；单性结实
中图分类号 S666 文献标识码 A
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而胚乳败育导致的柑橘无核，一般是由 2x × 4x 与 4x × 2x 倍性杂交引起的，打破了正常种子胚和胚乳 的倍性比，使胚乳败育，进而致使种子败育［7］。 在柑橘中，自交不亲和及单性结实也是导致其 果实无核的重要原因 。 自交不亲和性（self-incompat‐ ibility，SI）是指植物拒绝或抑制自身的花粉进入花 柱而防止自交，促使异交的现象，是植物调节自身来 适应环境变化的一种进化策略［8-9］。这个机制保证 了植物后代具有丰富的遗传背景，最大限度地使植 物更好地适应恶劣的生存环境，避免被自然淘汰［10］。 自交不亲和性一般由 S 位点的复等位基因控制，与该 位点连锁的 S-RNase 基因称 S 基因型 。Liang 等［11］ 利用全基因组重测序及 RNA-seq 数据，确定参与柑 |
场保留下来。
柑橘无核成因主要包括雄性不育、胚囊败育、胚 乳败育 、自交不亲和及环境因素等 。雄性不育在柑 橘中是非常普遍的现象，也是导致柑橘无核的主要 原因，表现为花粉败育［2］，如‘马叙葡萄柚’、温州蜜 柑、‘华柚 2 号’、‘华农本地早橘 ’等 。王蓉［3］利用细
胞学 、多组学及 sRNA-seq（小 RNA 测序）发现 Cs⁃ miR399a. 1 基因是调控柑橘雄性不育及生殖器官发 育的重要因子 。此外，雌性不育也是导致柑橘无核 的重要原因，其主要包括胚囊败育和胚乳败育［4］。 肖 金平等［5］通过切片观察到‘丽椪 2 号 ’胚囊母细胞在 后期完全退化 ，表明其无核是由胚囊败育导致的 ； ‘桂林良丰 ’无核的原因同样也是胚囊败育引起的［6］。
橘自交不亲和的 9 个 S-RNase 复等位基因，并且明确 不同柑橘品系一般具有不同的 S-基因型 。单性结实 是指一些品种在没有授粉的情况下果实发育的现 象；单性结实可分为刺激性单性结实和天然单性结 实又称为自主性单性结实［12］。 当自交不亲和及单 性结实能力同时存在时，就可产生无核果实。
‘东试早柚 ’是云南西双版纳东风农场试验站实
收稿日期：2024‐01‐24
基金项目：云南省科技厅重大科技专项（202102AE090054）；国家现代农业（柑橘）产业技术体系（CARS-26） 刘承浪，E-mail：448827890@qq.com
通信作者：邓秀新，E-mail：xxdeng@mail.hzau .edu .cn
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生选育的特早熟无核优良品种，故称为‘东试早柚’， 是云南热带亚热带地区主要的柚栽培品种之一，在 全省种植面积达 0 .8 万 hm2 以上，且种植面积仍呈上 升的趋势［13］。但随着‘东试早柚 ’产业的不断发展， 许多产区的果实多籽，其无核性状表现不稳定，也成 为制约其进一步发展的重要原因 。 因此，本研究利 用醋酸洋红和苯胺蓝染色法 、杂交授粉及分子标记 等手段探究‘东试早柚 ’无核成因，以期为其果实品 质提质增效、杂交育种、品种培育及该产业的进一步 发展提供重要理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试柑橘材料包括：西双版纳州景洪市热带作 物科学研究所柚试验基地的以‘酸柚 ’为砧木的 23 年 生‘ 东 试 早 柚 ’（Citrus grandis ［L. ］Osbeck cv . ‘Dongshi Zaoyou’）和湖北武汉市洪山区华中农业大 学国家柑橘种质资源圃的以‘酸柚 ’为砧木的 8 年生 ‘沙田柚’（Citrus grandis［L.］Osbeck cv .‘Shatiany‐ ou ’）及‘沙田柚 ’ב东试早柚 ’的 F1 代杂交群体。 1.2 醋酸洋红染色法及花粉活力检测方法 醋酸洋红染色液的配置参照叶丽霞［14］的方法并 作适当修改 。称取 1 g 洋红于 100 mL 45% 醋酸中煮 沸，冷却过滤后加入 4% 铁明矾，避光保存于棕色瓶 中以备用。 花粉活力测定：载玻片涂上醋酸洋红染色液，用 镊子取出花药，捣碎释放花粉粒，染色 5 min，使用光 学显微镜观察花粉活力 。用于检测花粉活力的花粉 数量共 2 264 粒。 1.3 花粉萌发力检测方法 花粉培养基的制备参考谭美莲 15］的方法并作适 当 修 改 。 具 体 成 分 包 括 ：0.02 % MgSO4，0.01 % KNO3，0.03 % Ca（NO3）2，0.01 % H3BO3，15 % PEG- 4000 以及 20% 蔗糖，pH 6.0 。花粉萌发力测定：用毛 笔蘸取少量花粉，拨弹于培养基中，在恒温（28±2℃) 培养箱中，避光培养 12h 后，用剪去枪尖的枪头吸取 萌发的花粉于载玻片上压片，通过光学显微镜观察 花粉萌发情况，以花粉萌发长度大于花粉粒直径时 视为萌发 。 用于检测花粉萌发力的花粉数量共 505 粒。 1.4 自交和杂交授粉后亲和性鉴定方法 自交授粉亲和性鉴定试验于 2022 年 2 月 11~12 日在西双版纳进行，花粉的采集、保存及授粉参照朱 |
2 遍后，于 70% 乙醇中放 4℃冰箱中保存备用 。亲和 性鉴定时弃 70% 乙醇，蒸馏水洗涤 2~3 遍，花柱于
4 mol/L NaOH 65℃ 恒温蒸煮 1.5 h，中间颠倒 2~3 次，待花柱由黄色转变为橙红色，弃 NaOH 溶液，用 蒸馏水每间隔 30min 洗 1 遍，直至花柱由橙红色转变 为黄白色 ，0.1 % 苯胺蓝染料染色 。加 2~3 滴 70% 甘油于载破片上，盖上盖玻片，按压至铺平，倒置荧 光显微镜观察花粉管的生长情况［17］。杂交授粉亲 和性鉴定试验于 2022 年 4 月 11 日在武汉进行，方法 同上。
1.5 去雄和非去雄套袋处理
去雄套袋处理为刺激性单性结实，选择‘东试早 柚 ’即将开放的顶端花蕾，去除已开放花朵、小花蕾 及畸形花，用镊子小心剥开花瓣，去除花药，保留花 丝，尽量不损伤雌蕊，立即套袋，用回旋针固定，作好 标记 。非去雄套袋处理则为天然单性结实，选择‘东 试早柚 ’即将开放的顶端花蕾，直接套袋，其余操作 方法同上 。套袋 85d 后统计其座果数。
1.6 利用 S-RNase鉴定杂交子代
‘东试早柚 ’及杂交子代叶片 DNA 提取参考程 运江［18］的方法 。利用已知的 2 个 S ⁃ RNase 基因序 列［19］设计特异性引物（表 1），在‘东试早柚 ’和‘沙田 柚 ’及杂交子代中进行 PCR 扩增 。PCR 反应体系20 µL，各组分为 10 .0 µL 2×Taq Mix，0.5 µL F（正向引 物 10 mmol/L），0.5 µL R（反 向 引 物 10 mmol/L）， 1.0 µL DNA（模板 300 ng/L），8.0 µL ddH2O 。PCR 反应程序为 94℃预变性 5 min，94℃变性 1 min，55℃ 退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 个循环，72℃终延伸 10 min，4℃ 保存 。PCR 扩增产物在 1 .0 % 琼脂糖凝胶
（0 .5×TBE 缓冲液）中电泳并由 Goldview（广州健阳 生物技术有限公司）显色后在凝胶成像系统下观察 结果。
1.7 数据处理
试验结果的数据采用 Microsoft Excel 2010 软件 对原始数据进行统计和整理，使用 Adobe Photoshop CC 2019 软件对原始图片进行处理。
2 结果与分析
2.1 ‘东试早柚 ’生长习性观察
‘东试早柚 ’树形一般为自然开心形，树势强，花
表 1 S 基因型鉴定的特异性引物及退火温度
Table 1 Specific primers and annealing temperature for S-genotypes identification
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引物名称 Primer name |
引物序列（5 ′―3 ′）Sequence |
退火温度/℃ Annealing temperature |
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S5 |
F：ATGAAGGTGGCATCCATCAAC R：CTACCACCGTGGTGGGAAAATAATATCC |
56 |
|
S6 |
F：ATGGGGACTAATTTCCTCATTATC R：CTATATTTTAACGTATCGCGGC |
55 |
量大，花器官较大，花期以 2 月上旬至 3 月上旬为主， 在热带地区具有周年开花的特性 。座果一般以当年 12 月及翌年 2 月开花为主，果实特早熟，可于 7 月下 旬至 8 月上旬上市 。果型呈倒卵形，果皮和果肉浅黄
的大多数柑橘品种的雄蕊花药花粉表型特征相 一致。
2.2 ‘东试早柚 ’花粉活力及花粉萌发力检测
‘东试早柚 ’花粉染色活力结果如图 2 A、表 2 所
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示 ，5个视野内具有染色活力的花粉比率分别为 94.19 %、94.80 %、93.99 %、95.45 %、95.58 %，花粉活 力比率均值为 94 .80 %。‘东试早柚 ’花粉萌发试验结 果 表 明 ，5 个 视 野 内 花 粉 萌 发 率 分 别 为 89.31 %、 90.21 %、89.22 %、80.65 %、81.63 %，萌 发 率 均 值 为 86.20 %（图 2B、表 2）。 结果表明，‘东试早柚 ’的花粉 均具有较高的花粉活力及花粉萌发力。 |
图 1 ‘ 东试早柚 ’花结构
Fig. 1 Flower structure of‘Dongshi Zaoyou ’pummelo
图2 ‘ 东试早柚 ’花粉染色活力及花粉萌发情况
Fig. 2 Pollen staining and germination state of‘Dongshi Zaoyou ’pummelo
2.3 ‘ 东试早柚 ’自交和杂交亲和性及 F1 代杂种 鉴定
观察‘东试早柚 ’自交授粉后花粉管的生长萌发 状态，发现大量的花粉粒在花柱顶端萌发，但花粉管
向子房生长却受到抑制而停止生长（图 3A），表现为 不亲和状态 。 同时，以‘沙田柚 ’为母本、‘东试早柚 ’ 为父本进行杂交授粉，观察发现大量的花粉管向下 延伸穿过花柱能够到达雌蕊基部（图 3B），表现为亲
表2 ‘ 东试早柚 ’花粉染色活力与花粉萌发率
Table 2 Pollen staining and germination rates of‘Dongshi Zaoyou ’pummelo
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项目 Items |
视野 1 |
视野 2 |
视野 3 |
视野 4 |
视野 5 |
平均值±标准差 |
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Sight 1 |
Sight 2 |
Sight 3 |
Sight 4 |
Sight 5 |
Mean±SD |
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花粉活力比率 Pollen vitality |
94.19 |
94.80 |
93.99 |
95.45 |
95.58 |
94.8 ±0.72 |
|
花粉萌发率 Germination rate |
89.31 |
90.21 |
89.22 |
80.65 |
81.63 |
86.2 ±4.65 |
和状态。
待果实成熟后采摘‘沙田柚 ’ב东试早柚 ’杂交 果实，取其种子进行催芽播种，共获得 F1 代杂交群体 175 株 。通过 S 基因型鉴定发现，‘东试早柚 ’的 S 基 因型为 S5、S6（图 4），并进一步利用‘东试早柚 ’S -
明：在 F1 代中有 85 株杂交后代含有与其父本相同的 S5 -RNase 特异性条带，79 株杂交后代含有与其父本 相同的 S6 -RNase 特异性条带，11 株杂交后代未检测 到与其父本相同的 S-RNase 特异性条带（图 5）。 因 此共获得以‘ 东试早柚 ’为父本的真杂种后代
图4 ‘ 东试早柚 ’的 S基因型鉴定
Fig. 4 S-genotypes of‘Dongshi
Zaoyou ’pummelo identified
2.4 ‘东试早柚 ’单性结实能力鉴定
单性结实一般是在子房未经授粉或授粉但未受 精而产生无核果实的性状［12］。2021―2022 年对‘东 试早柚 ’进行去雄套袋和非去雄套袋的田间重复性
的座果率显著高于去雄套袋的座果率。
3 讨 论
植物界显花植物的花一般由花托 、花萼 、花瓣 、 雄蕊和雌蕊构成，而雄蕊由花丝和花药构成，花丝主 要负责花药所需各种营养物质的运输，花药则是产 生花粉粒的器官，因此花药能否正常的发育很大程
图 5 ‘沙田柚 ’ב东试早柚 ’杂交 F1 代 S基因型遗传鉴定
Fig. 5 Genetic identification S-genotypes in F1 hybrid population of‘Shatianyou’pummeloבDongshi Zaoyou’pummelo
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表 3 ‘ 东试早柚 ’去雄和非去雄套袋情况统计 Table 3 The results of emasculation-bagging and non-emasculation-bagging of‘Dongshi Zaoyou ’pummelo |
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度上决定了植物的育性［20］。根据花药败育的形式 ， 雄性不育可分为花药原基、绒毡层细胞、花粉壁、减 数分裂和胼胝质代谢异常等类型［21］。 叶丽霞［14］通 过形态学观察‘华农无核椪柑 ’花药发育过程发现 ， ‘华农无核椪柑 ’花药散粉较少，花粉粒多数无活性 ， 在体内体外都无法正常萌发且减数分裂异常 。李蒙 蒙［22］基于石蜡切片及电镜扫描等方法发现，‘抛橘 ’ 花粉的染色活力和花粉萌发力处在一个正常的水平 且花粉粒超微结构形态大部分为正常形态，排除了 ‘抛橘 ’雄性不育的可能性 。本研究从形态学角度对 ‘东试早柚 ’的花进行解剖发现，其雄蕊、雌蕊等花结 构发育完整，且肉眼观察到花药及花粉与正常的柑 橘品种表现相近，因此排除畸形花是其无核的可能。 此外，本研究检测了‘东试早柚 ’花粉活力比率、花粉 萌发率，均处于较高水平，因此可初步排除雄性不育 是导致其无核的可能。 柑橘自交不亲和是花结构完整且生殖系统均能 正常发育，如‘琯溪蜜柚’、‘缅甸柚 ’等［19］，但发育成 熟的花粉授到自身的花柱上，花粉在花柱顶端受到 阻止或干扰而不能向下生长，这也是导致柑橘无核 的普遍原因之一［23］。梁梅［19］基于甜橙及克里曼丁 橘测序数据和 60 份柚资源的转录组数据，定位到控 |
单性结实是许多作物产生无核果实的重要原 因 。 目前柑橘品种温州蜜柑、‘黔阳无核 ’椪柑、克里 曼丁橘和大多数脐橙等均具有一定的单性结实能力 和座果率［26-28］。赵科科［29］通过转录组测序及关键基 因的挖掘及功能分析，初步解析了‘琯溪蜜柚 ’和‘沙
田柚 ’单性结实的生理和细胞学基础，并明确了‘琯 溪蜜柚 ’单性结实能力显著高于‘沙田柚’。本研究 对‘东试早柚 ’进行去雄套袋和非去雄套袋处理来探 究其单性结实能力，连续 2a 的田间重复性试验结果 显示，去雄套袋后平均座果率（13 .04 %）显著低于非 去雄套袋平均座果率（25 .56 %），表明‘东试早柚 ’具 有较强的单性结实，且天然单性结实能力高于刺激 性单性结实，推测原因可能是由于去雄处理过程中 损伤了花柱、花瓣和花丝等花结构，导致其刺激性单 性结实能力下降。
在柑橘无核机制研究中，雄性不育、自交不亲和
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Studies on the seedlessness mechanism in‘Dongshi Zaoyou ’pummelo
LIU Chenglang1 ,2 ,HUANG Wenkai1 ,YAN Suyun2 ,ZHOU Xianyan2 ,DONG Meichao2 , XU Xiangzeng3 ,GAO Shide3 ,GAO Junyan2 ,CHAI Lijun1 ,DENG Xiuxin1
1.National Key Laboratory for Germplasm Innovation &Utilization of Horticultural Crops/
College of Horticulture and Forestry Sciences，Huazhong Agricultural University，
Wuhan 430070，China；
2.Institute of Tropical and Subtropical Cash Crops，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，
Baoshan 678000，China；
3. Yunnan Institute of Tropical Crops，Jinghong 666100，China
Abstract ‘ Dongshi Zaoyou ’pummelo and its hybrid offsprings，methods including magenta acetate staining and aniline blue staining ，cross-pollination，and molecular markers were used to study the mecha‐ nism of seedlessness in‘ Dongshi Zaoyou ’pummelo .The results showed that the floral structure of‘Dong‐ shi Zaoyou ’pummelo was intact，with pollen vitality and germination rates of 94.80 % and 86.20 % ，respec‐
tively. The self-pollination of‘ Dongshi Zaoyou ’pummelo showed incompatibility ，while cross-pollination with‘ Shatian ’pummelo showed compatibility.A total of 164 F1 hybrids were identified from 175 hybrid offsprings of‘Shatian ’pummelo ב Dongshi Zaoyou ’pummelo with S5/S6 molecular marker genotyping ， ruling out the possibility of male sterility in‘ Dongshi Zaoyou ’pummelo .The results of observation for two consecutive years showed that the mean fruit setting rates of stimulating parthenocarpy and natural partheno ‐ carpy in‘ Dongshi Zaoyou ’pummelo was 13.04 % and 25.56 % ，respectively. It is indicated that the main reason for the seedless development of‘ Dongshi Zaoyou ’pummelo is its self-incompatibility and certain ability to produce parthenocarpy.
Keywords ‘ Dongshi Zaoyou ’pummelo；male sterility；self-incompatibility；parthenocarpy
（责任编辑：葛晓霞）
